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技术简介
净信实业生物的单细胞测序使用自助研发的单细胞测序样本制备仪进行单细胞的分离。技术原理为Drop-seq技术*。该技术可在极短时间内同时获得数十万个单细胞转录组信息，而且相较于其他平台，成本大大降低。
优势
高通量：一次可以得到数百至数万甚至更多细胞的转录组
低成本：每个细胞成本不超过10元
个性化：可根据客户分析需求提供个性化分析
一站式：从样品制备到数据深度分析一站式服务
应用领域
? 核心
细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测
? 涵盖大部分细胞类型
生殖细胞、胚胎细胞、血细胞、神经细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞等；
? 功能：
a) 细胞亚群分类
b) 鉴定稀有细胞类型
c) 病理诊断
d) 特异性分子标记筛选等
结果展示
1. 细胞barcode鉴定及UMI数目统计
对得到的细胞数及基因数目进行统计，并对数据质控分析
2. t-SNE方法对不同细胞类型聚类分析
多个样本的t-SNE分析，可以得到不同样本的细胞亚型分布差异，比较正常和疾病模型样本，得到疾病模型样本的差异分布的细胞亚型和部位。
3．marker鉴定
筛选得到不同亚型细胞的marker基因，通过violin图、t-SNE图看出marker基因在不同亚型细胞中的表达情况。
1.研究背景
异质细胞群体中的细胞多样性能够对细胞存活和增殖、对药物疗法和干预作出的反应以及很多其他的生物过程产生深刻影响。高通量单细胞转录组测序可用来研究黑色素瘤组织多样性的复杂细胞微环境。
2.方法流程
? 通过流式分选了来自于 19 个患者的 4,645 细胞进行单细胞转录组测序；每个细胞 15 万Reads 数。? 荧光免疫组化分析。
3.研究结果
? 单细胞转录谱区分恶性细胞和非恶性细胞的状态
通过 CNV 分析确定为恶性的细胞，然后根据其基因表达情况进行了 TSNE 降维分析，恶性细胞分为 6 个亚型，表明了肿瘤的异质性。而非恶性细胞则相反，主要是通过细胞类型进行了区分，比如 T 细胞、 B 细胞、巨噬细胞、内皮细胞、癌相关成纤维细胞（ CAFs）和 NK 细胞（图1）。
异质细胞群体中的细胞多样性能够对细胞存活和增殖、对药物疗法和干预作出的反应以及很多其他的生物过程产生深刻影响。高通量单细胞转录组测序可用来研究黑色素瘤组织多样性的复杂细胞微环境。
2.方法流程
? 通过流式分选了来自于 19 个患者的 4,645 细胞进行单细胞转录组测序；每个细胞 15 万Reads 数。? 荧光免疫组化分析。
3.研究结果
? 单细胞转录谱区分恶性细胞和非恶性细胞的状态
通过 CNV 分析确定为恶性的细胞，然后根据其基因表达情况进行了 TSNE 降维分析，恶性细胞分为 6 个亚型，表明了肿瘤的异质性。而非恶性细胞则相反，主要是通过细胞类型进行了区分，比如 T 细胞、 B 细胞、巨噬细胞、内皮细胞、癌相关成纤维细胞（ CAFs）和 NK 细胞（图1）。
图1 恶性细胞和非恶性细胞分群结果
? 恶性细胞的分析揭示了细胞周期的异质性
使用 G1 或 S／M 期的标志性基因来分析恶性细胞的不同亚群（图 2），该分析揭示了在肿瘤组织中，循环的细胞所占的比例平均为 13.5%；也区分低循环状态的细胞和高循环状态的细胞，比如 Mel79 处于低循环、而 Mel78 则处于高循环状态的肿瘤。 KDM5B 基因的表达与非循环状态的肿瘤有高度相关性，它在小鼠模型中编码 H3K4 组蛋白去甲基酶，这个酶与低循环相关，同时也有类似于黑色素瘤干细胞的耐药性的特征。
使用 G1 或 S／M 期的标志性基因来分析恶性细胞的不同亚群（图 2），该分析揭示了在肿瘤组织中，循环的细胞所占的比例平均为 13.5%；也区分低循环状态的细胞和高循环状态的细胞，比如 Mel79 处于低循环、而 Mel78 则处于高循环状态的肿瘤。 KDM5B 基因的表达与非循环状态的肿瘤有高度相关性，它在小鼠模型中编码 H3K4 组蛋白去甲基酶，这个酶与低循环相关，同时也有类似于黑色素瘤干细胞的耐药性的特征。
图2细胞所处循环状态展示图
? 非恶性细胞以及他们在黑色素瘤微环境中的相互作用
各种各样的非恶性细胞组成了肿瘤的微环境，微环境的组成对肿瘤的发要影响。通过单细胞测序的数据区分了微环境中不同细胞的类型（图 3），包括T细胞、B 细胞、巨噬细胞、内皮细胞和肿瘤相关的成纤维细胞（ CAFs），并通过特征标签揭示了这些细胞在微环境中的相对丰富程度。
各种各样的非恶性细胞组成了肿瘤的微环境，微环境的组成对肿瘤的发要影响。通过单细胞测序的数据区分了微环境中不同细胞的类型（图 3），包括T细胞、B 细胞、巨噬细胞、内皮细胞和肿瘤相关的成纤维细胞（ CAFs），并通过特征标签揭示了这些细胞在微环境中的相对丰富程度。
图3 大量黑色素瘤细胞之间的数据拆分解揭示了细胞与细胞间的相互作用
? 肿瘤浸润性 T 淋巴细胞的多样性及其功能状态
肿瘤浸润淋巴细胞（ TILs），尤其是 CD8 + T 细胞是免疫监视的主要决定因素。单细胞测序分析来推断各种类型 T 细胞的功能，从而有助于研究对免疫检查抑制剂的肿瘤反应和抵抗（图 4）：通过特征性标记定义了 T 细胞的主要亚群，比如 CD4+,Tregs， CD8+等（图 3A）。然后通过耗竭基因分析了细胞的耗竭状态，并通过免疫组化验证（图 4B 和 4C）。最后分析了细胞毒 T 细胞中耗竭 T 细胞的特征表达状态，以及高耗竭和低耗竭细胞的基因表达情况（图 4D、 E、 F），并进行了 TCR 分析（图 4G 和 H）。
肿瘤浸润淋巴细胞（ TILs），尤其是 CD8 + T 细胞是免疫监视的主要决定因素。单细胞测序分析来推断各种类型 T 细胞的功能，从而有助于研究对免疫检查抑制剂的肿瘤反应和抵抗（图 4）：通过特征性标记定义了 T 细胞的主要亚群，比如 CD4+,Tregs， CD8+等（图 3A）。然后通过耗竭基因分析了细胞的耗竭状态，并通过免疫组化验证（图 4B 和 4C）。最后分析了细胞毒 T 细胞中耗竭 T 细胞的特征表达状态，以及高耗竭和低耗竭细胞的基因表达情况（图 4D、 E、 F），并进行了 TCR 分析（图 4G 和 H）。
图 4 T 细胞耗竭特征基因的激活依赖和非激活依赖变异
4.研究结论
通过对黑色素瘤开展的大规模单细胞转录组测序，系统研究了肿瘤内的不同细胞亚群的组成、细胞亚群的功能以及肿瘤的微环境，为准确免疫治疗提供了参考。
1.单细胞测序技术的应用方向？
高通量单细胞转录组测序可以应用到的研究领域包括：细胞异质性研究、发育及分化、免疫反应、新型细胞发现、定点编辑基因的细胞水平研究、疾病分型、构建细胞图谱等。
2.单细胞转录组测序可以应用于哪些细胞类型呢？
单细胞转录组测序在研究细胞异质性问题中具有显著价值。因此可应用于多种存在异质性的细胞类型，包括生殖细胞、胚胎细胞、神经细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞、其他原代细胞；
3.上机的细胞悬液的要求是怎样的？
我们要求单细胞悬液细胞总量大于10w个，活细胞比例大于80%， 细胞成团率低于2%。
4.高通量单细胞转录组测序一次大概能测多少细胞？
可测细胞数目100-10000个，具体细胞数要根据需求及上样细胞数不同而不同。
5.测序时，是测的转录本全长吗？
测序为非全长。目前高通量单细胞测序都只能做到测3’端的序列信息。
6.测序数据量如何确认？
测序数据量是根据细胞数量确认的，每个细胞平均30M数据量。
高通量单细胞转录组测序可以应用到的研究领域包括：细胞异质性研究、发育及分化、免疫反应、新型细胞发现、定点编辑基因的细胞水平研究、疾病分型、构建细胞图谱等。
2.单细胞转录组测序可以应用于哪些细胞类型呢？
单细胞转录组测序在研究细胞异质性问题中具有显著价值。因此可应用于多种存在异质性的细胞类型，包括生殖细胞、胚胎细胞、神经细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞、其他原代细胞；
3.上机的细胞悬液的要求是怎样的？
我们要求单细胞悬液细胞总量大于10w个，活细胞比例大于80%， 细胞成团率低于2%。
4.高通量单细胞转录组测序一次大概能测多少细胞？
可测细胞数目100-10000个，具体细胞数要根据需求及上样细胞数不同而不同。
5.测序时，是测的转录本全长吗？
测序为非全长。目前高通量单细胞测序都只能做到测3’端的序列信息。
6.测序数据量如何确认？
测序数据量是根据细胞数量确认的，每个细胞平均30M数据量。
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